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技術(shù)文章
蛋白質(zhì)含量是糧食營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要標(biāo)志之一,特別是隨著目前我國(guó)生活水平的不斷提高,該指標(biāo)亦愈來愈被人們所重視。我國(guó)測(cè)定糧食粗蛋白的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法為凱氏定氮法(GB5511一85),但傳統(tǒng)凱氏燒瓶的方法在對(duì)樣品消化液蒸餾過程中不僅操作繁瑣、費(fèi)時(shí),而宜需要的儀器設(shè)備亦比較特殊、復(fù)雜,從而給糧食粗蛋白的測(cè)定普及工作帶來了諸多不便。本文以全自動(dòng)凱氏定氮儀高自動(dòng)化及樣品數(shù)據(jù)穩(wěn)定性取代傳統(tǒng)凱氏燒瓶繁瑣操作，為蛋白測(cè)定工作提供安全快速的分析方法：
1、 1.目的 測(cè)定糧食、糧油制品中粗蛋白的含量
2.范圍 含氮量0.02%-95%之間的糧食、油料
3.定義 無
4.職責(zé) 檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)檢驗(yàn)工作的執(zhí)行
5.作業(yè)辦法
5.1 晶品JPD200全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定法
5.1.1工作原理
JPD200全自動(dòng)凱氏定氮儀是由消解儀與定氮儀蒸餾器組成。將試樣置入消化管插入JPH500紅外消解儀內(nèi)加熱取得*的熱效應(yīng)，在消化之前置入催化劑進(jìn)一步加速消化煮解，大大縮短消化時(shí)間。消化管內(nèi)溢出的SO2等有害氣體，通過消化管上的排污管經(jīng)抽氣三通由下水道帶入下水道，有效的抑制了有害氣體的外溢，試樣經(jīng)60分鐘左右消化煮解，即可*消化盡。
5.1.2技術(shù)參數(shù)
5.1.2.1測(cè)定樣品量：固體<5g/個(gè)，液體<15ml/個(gè)
5.1.2.2工作電壓：220V，50HZ
5.1.2.3電耗：蒸餾器1600W、消解儀（6孔1500W）(12孔2000W) (20孔2500W)
5.1.3操作方法
5.1.3.1試劑準(zhǔn)備
5.1.3.1.1濃硫酸混合液 在100mL水中緩緩加入濃硫酸200mL，冷卻后加入30%過氧化氫300mL，混合均勻。
5.1.3.1.2混合催化劑 硫酸銅10g、硫酸鉀100g、硒粉0.2g，在研缽中研細(xì)過孔徑0.45mm（40目篩），混勻備用。
5.1.3.1.3 混合指示劑0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL,0.1%甲基紅乙醇溶液7 mL,，密封保存（保存期一個(gè)月），PH值4.5—5.5之間，否則應(yīng)用稀酸稀堿調(diào)節(jié)；
5.1.3.1.4 20g/L硼酸溶液 稱取10g硼酸溶解在1000mL水中。
5.1.3.1.5 400g/L氫氧化鈉溶液 稱取40g氫氧化鈉溶于100mL水中。
5.1.3.1.6 0.1mol/L鹽酸溶液
5.1.3.1.6.1配置
先配置0.1mol/L鹽酸，量取9mL濃鹽酸，加水定容至1000mL。
5.1.3.1.6.2 0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定
稱取0.2g于270℃-300℃灼燒至恒重的工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示液，用配置好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2min，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色。同時(shí)做空白試驗(yàn)。
5.1.3.1.6.3 計(jì)算
C(HCL)= 1000×m(V1-V2)×52.994
公式中 C(HCL)——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；
m——無水碳酸鈉的質(zhì)量，g
V1——鹽酸溶液的用量，mL
V2——空白試驗(yàn)鹽酸溶液的用量，m；
M——無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量，其值為M（1/2Na2CO3)=52.994g/mol。
5.1.3.2樣品消化
稱取經(jīng)粉碎通過40-60目的樣品0.5-1.0g用蠟光紙卷著倒入已洗滌烘干的消化管中加催化劑5g左右和10mL左右硫酸。將消化管分別放入消化架各個(gè)孔內(nèi)，然后置于消化爐上，然后開啟抽氣三通接上自來水，使抽氣三通處于吸氣狀態(tài)，接通電源，在加熱初始階段注意防止樣品飛濺。消解儀溫度起先控制在200度左右，20分鐘后可以再設(shè)定至450度以上。
消化終點(diǎn)是以消化液的顏色來判定的，當(dāng)消化液呈淺藍(lán)綠色的透明狀時(shí)，再繼續(xù)加熱沸騰10分鐘，然后結(jié)束消化過程。
5.1.3.3 蒸餾
5.1.3.3.1蒸餾器中，堿液及蒸餾水采用獨(dú)立定量泵加入，NaOH、H2O注入接口用橡膠管套入后分別置入自備的容器中，加液時(shí)按面板上運(yùn)行開關(guān)，硼酸溶液、堿液由儀器自動(dòng)分別添加入滴定杯和消化管內(nèi)。（一般硼酸加30ML，堿液加入量是消化時(shí)硫酸用量的5倍以上，加蒸餾水量15毫升左右）。
5.1.3.3.2 打開電源，打開自來水，接冷卻水，自來水不必開過大，出水口有水流出低壓開關(guān)不報(bào)警提示即可，用排水管子上的夾子夾緊排水管子。。
5.1.3.3.3 打開左側(cè)安全防護(hù)門把消化管固定在左邊托架上，然后按面板上運(yùn)行按鍵自動(dòng)加入溶液，自動(dòng)蒸餾，根據(jù)蒸餾回收液與硼酸反應(yīng)產(chǎn)生顏色的變化，儀器高精度顏色傳感單元與1ul/步高精度滴定單元配合注入鹽酸滴定液，直至將回收液滴至灰紫色，在沒有氨水蒸餾至滴定杯后儀器自動(dòng)停止滴定，并根據(jù)內(nèi)置計(jì)算公式自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果，根據(jù)需要按打印按鍵打印結(jié)果。按下式計(jì)算蛋白含量：
蛋白含量（%）=（V-V0）×N×0.014×A×100/W
式中：V——消耗的鹽酸的毫升數(shù)
V0——空白試驗(yàn)時(shí)消耗鹽酸毫升數(shù)
N——鹽酸的當(dāng)量濃度
0.014——1mL鹽酸的克當(dāng)量數(shù)
A——固定系數(shù)（6.25、5.7、5.3）
W——試樣重量,g
全自動(dòng)凱氏定氮儀滴定精度高，穩(wěn)定性好，相比人工滴定節(jié)省大量時(shí)間而且提高了數(shù)據(jù)的可靠性。
5.1.3.5關(guān)機(jī)
關(guān)電源、關(guān)水、打開安全門取下消化管，擦干機(jī)器。
5.1.4注意事項(xiàng)
5.1.4.1 消化時(shí)如氣體外逸，加大自來水壓力。小花圈每次試驗(yàn)結(jié)束后清洗一遍延長(zhǎng)使用壽命。堿泵每次工作完后把氫氧化鈉溶液外接皮管移入蒸餾水瓶?jī)?nèi)，前面套好消化管抽洗幾次，防止堿濃度過高，殘留在堿泵內(nèi)而影響壽命年工也可防止單向閥閥芯粘連。待下次使用時(shí)，在蒸餾時(shí)須排出100mLNaOH，以防止*個(gè)樣品NaOH濃度不夠。
5.2 傳統(tǒng)凱氏燒瓶測(cè)定蛋白的分析方法供參考
5.2.1儀器和用具
5.2.1.1 凱氏燒瓶：50ml；
5.2.1.2 圓底燒瓶：100ml；
5.2.1.3 萬用電爐；
5.2.1.4 錐形燒瓶：100ml；
5.2.1.5 微量滴定管：5ml、刻度0.01ml；
5.2.1.6 容量瓶：50ml；
5.2.1.7 移液管：5ml；
5.2.1.8 量筒：10ml；
5.2.1.9 洗耳球；
5.2.2 試劑 同上
5.2.3 操作方法
5.2.3.1 消化
稱取經(jīng)粉碎通過40-60目的樣品0.2～0.3g（W，到0.0001g），用蠟光紙卷著倒入洗凈烘干的50ml凱氏燒瓶中，加混合指示劑1g,同時(shí)加入硫酸-過氧化氫-水混合液3～5ml，稍加振搖，斜置于電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱進(jìn)行消化。開始時(shí)用低溫加熱，勿使瓶中泡沫超過瓶肚的三分之二，待泡沫減少和煙霧變白后再增加溫度保持微沸。消化到溶液呈淺藍(lán)綠色的透明狀時(shí)，再繼續(xù)加熱沸騰10min，取出待消化液冷卻至室溫后，加水10～20ml，再待溶液溫度降到室溫后，干凈地轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻備用。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。
5.2.3.2 蒸餾
在燒瓶?jī)?nèi)加水400ml和少量沸石，加5滴混合指示劑，加幾滴酸液使水呈紫紅色，連接蒸餾裝置，并檢查有無漏氣處。
量取30ml1%硼酸溶液注入錐形瓶?jī)?nèi)，加混合指示劑2滴，使冷凝管下端插入液面下1cm處。量取稀釋的消化液5ml，由漏斗注入蒸餾瓶?jī)?nèi)，再加水10ml，沖洗加液漏斗。量取40%氫氧化鈉溶液1ml，提起活塞注入蒸餾瓶?jī)?nèi)，立即用水2～5ml沖洗漏斗，旋緊活塞。這時(shí)蒸餾瓶?jī)?nèi)溶液總體積不要超過其容量的一半。
打開簧夾，關(guān)閉活塞，加熱燒瓶，待蒸餾瓶?jī)?nèi)溶液開始沸騰時(shí)開始計(jì)時(shí)，經(jīng)2min降低錐形瓶，使冷凝管下端露出液面，再蒸餾1min后，用水沖洗管下端。
蒸餾結(jié)束后，掐緊簧夾，斷絕蒸氣，使蒸餾瓶?jī)?nèi)溶液全部吸入回流管中，放松簧夾，從漏斗加入蒸餾水40～50ml，再通蒸氣加熱和回流，將蒸餾瓶洗滌一次備用。
5.2.3.3 滴定
用0.01 mol/L鹽酸溶液滴定錐形瓶?jī)?nèi)的吸收液，滴定溶液出現(xiàn)淺紫紅色為止。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。
5.2.4 結(jié)果計(jì)算
粗蛋白質(zhì)的干基含量按下列公式計(jì)算：
粗蛋白質(zhì)（干基%）= （V1-V0）×N×14×P×50v ×10000W(100-M)
式中：V——蒸餾時(shí)取用稀釋的消化液體積，ml；
V1——實(shí)驗(yàn)用去的鹽酸溶液體積，ml； 1
V0——空白試驗(yàn)用去的鹽酸溶液體積，ml；
N——鹽酸溶液的當(dāng)量濃度，N；
14——每毫克當(dāng)量鹽酸相當(dāng)于氮的毫克數(shù)；
P——蛋白質(zhì)換算系數(shù)（小麥5.7，其他谷物及豆類6.25）；
W——試樣重量，mg；
M——試樣水分百分率，%。
5.2.5 注意事項(xiàng)
5.2.5.1 消化過程中若硫酸損失過多，可酌情補(bǔ)加硫酸，勿使消化瓶?jī)?nèi)干涸。
5.2.5.2 加入蒸餾瓶?jī)?nèi)的堿液必須過量。
5.2.5.3 消化液加水稀釋后，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行蒸餾。
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